AG百家乐的实验原理：平头连接是一种技术手段，通过将合适的平头载体与经过补平或削平处理的PCR产物直接连接来进行克隆实验。可以使用EcoRV或SmaI对载体进行平头切割。PCR产物在经过纯化后，可以在22℃下利用DNA聚合酶I处理30分钟，该酶具备3'→5'外切酶活性和5'→3'的聚合酶活性。如果对连接的要求不太高，也可以选择不对PCR产物进行处理。使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶时，这些酶拥有5'→3'的校对能力，因此扩增得到的PCR产物已经是平头，可以直接使用。平头连接的一个主要缺点在于其连接效率较低，尽管使用较高单位的连接酶，或在反应体系中添加PEG8000，也只能有限提高效率。通常情况下，PCR产物可以直接与平头载体DNA连接，但连接效率仍较低。这是因为Taq DNA聚合酶的非模板依赖性末端转移酶活性，会在DNA链的3'末端增加一个多余的碱基，导致生成的PCR产物含有3'突出一个碱基的结构，这种结构的连接效率相对较低。借助于较高浓度的T4 DNA连接酶与5-10u T4 RNA连接酶的共同使用，可以有效提升连接效率。对于较短的PCR产物，通过使用PUS19的HincⅡ位点进行克隆，并结合X-gal和IPTG筛选，通常可以获取足够的重组子。另一种提高克隆效率的方式是先用Klenow大片段或T4 DNA聚合酶去除3'末端的突出碱基，使PCR产物转变为平头DNA后再进行平端连接克隆。

实验步骤

一、PCR反应

1. 将以下试剂依次混合：H2O：35μl，10×PCR反应缓冲液：5μl，25 mmol/L MgCl2：4μl，四种dNTP：4μl，上游引物（引物1）：0.5μl，下游引物（引物2）：0.5μl，模板DNA（约1 ng）：0.5μl。混合后离心5秒。

2. 将混合物在94℃加热5分钟后迅速冷却，然后离心数秒，使管壁上的液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶（0.5μl，约25U），混合均匀，稍作离心后用一滴矿物油覆盖于反应混合物上。

3. 进行PCR循环，包括94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，重复35轮。最后一轮循环后于72℃保温10分钟，以确保产物充分扩增。

二、电泳分析

取10μl扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，以检测反应产物及其长度。

三、PCR产物的纯化

扩增后的PCR产物若用于T-Vector进行克隆，可直接使用，但若进行平端或粘性端连接，通常需对产物进行纯化。

1. 酚/氯仿法：取反应产物加100μl TE，加入等体积氯仿混匀后用微型离心机以10000 rpm离心15秒，把上层水相转移至新小管中。再进行两次酚/氯仿提取，收集上层水相，最后加入300μl 95%乙醇，置于-20℃下沉淀30分钟。

2. 使用AG百家乐的Wizard PCR DNA纯化系统，快速、有效地提取PCR扩增液中的DNA。该系统包含足够的试剂与柱子，可进行多达50次的PCR纯化。步骤包括：取PCR反应液，加入提取缓冲液，加入PCR DNA纯化树脂，混合并进行离心，最后得到纯化的DNA。

四、载体加dT尾

1. 使用SmaI对1μg pUC19质粒全酶切。

2. 根据上述PCR反应，将多种混合物添加至小管中，4μl四种dNTP换为4μl 25 mmol dTTP。

3. 加入1μl（5U）的Taq DNA聚合酶，在72℃下加热2小时。

4. 按前述方法用酚/氯仿提取两次，沉淀后洗涤并溶解于10μl ddH2O中。

五、PCR产物与载体的粘末端连接

1. 在7μl PCR产物中添加1μl带dT尾的pUC质粒，加入1μl T4 DNA连接酶和1μl 10×连接缓冲液，混合后在16℃下连接过夜。

2. 取5μl连接产物转化入感受态细胞并筛选重组子。

六、PCR产物的3'突出端切平及平末端连接

1. 在50μl PCR产物中加入0.5μl T4 DNA聚合酶，混合均匀后，37℃反应10分钟，随后在70℃灭活10分钟。

2. 用酚/氯仿提取两次，进行乙醇沉淀和洗涤，后溶解于7μl ddH2O中。

3. 对质粒进行SmaI切割后，70℃灭活酶15分钟，将1μl（约0.1mg）加入PCR产物中，加入1μl T4 DNA连接酶和1μl连接缓冲液。

4. 取5μl连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。

注意事项

1. PCR反应液可直接用于连接，但建议对PCR产物进行纯化，以去除dNTP和ATP对连接酶的竞争，浓缩PCR产物。

2. PCR过程极为敏感，所有操作应尽量在无菌操作台内进行。

3. 所有吸头和离心管需进行高压灭菌，每次使用后更换，以避免交叉污染。

4. 添加试剂前应短暂离心，以防手套污染和试剂的相互污染。

5. 应设立包含其他成分的负对照，以确保结果的可靠性。

6. 使用的纯化树脂在使用前需充分混匀。

7. PCR产物中的矿物油应尽量去除，以确保DNA提取量的准确性。