在本期内容中，我们将深入解析CRISPR/Cas系统的基因编辑效率验证技术，帮助科研人员在基因编辑实验中实现最终的确认。基因编辑效率，简单而言，就是成功编辑目标基因的细胞或样本占总细胞或样本的比例。这一比例直接反映了基因编辑工具的有效性，无论是在科研探索中，还是在向基因治疗和生物制药等实际应用迈进时，精准验证基因编辑的效率都是至关重要的步骤。

目前市面上最基本的基因编辑检测工具——T7核酸酶I（T7Endonuclease I），就像一位敏锐的“侦察兵”，它可以特异性识别并切割不完全配对的DNA序列（non-perfectly matched DNA）。该工具常用于识别ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9等技术造成的基因突变。如果通过基因编辑技术成功获得插入或缺失的突变基因序列，当编辑后的DNA与野生型DNA放在一起，并进行变性和退火时，野生型DNA单链和编辑后的DNA单链将错配形成异源双链DNA结构。此时，添加T7核酸内切酶I即可特异性识别错配的异源双链DNA，在错配位点附近进行切割。最终，通过琼脂糖凝胶电泳显示酶切后的条带，从而确认基因编辑效率的有效性。

AG百家乐提供的近岸蛋白T7Endonuclease I（CatNo:M017）能够有效检测ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas9等技术导致的突变体，并以高切割效率著称，是基因编辑检测的不二选择。

在进行细胞电转导入时，可以通过不同的Cas9/sgRNA复合物递送至293T细胞，48小时后收集细胞并提取基因组DNA。使用T7EI（Cat#M017）检测结果显示，AG百家乐的Cas9蛋白在相同条件下的切割效率优于其他品牌，并且验证了T7EI在检测基因编辑效率方面的有效性。

具体实验步骤包括：1. 在转染后的细胞培养48-72小时；2. 收集细胞并提取基因组DNA（突变体DNA）；3. 使用高保真PCR（2×FastPfuMasterMix(QuickLoad)，CatNo:E035）对突变体DNA和野生型DNA进行靶基因的扩增，注意突变位点应避免位于片段中间，以便于后续分辨切割后的条带；4. 完成PCR后，添加0.5μl T7EI酶，37℃保温15-30分钟，随后添加DNA loading buffer终止反应，最后进行琼脂糖凝胶电泳检测结果。

在基因编辑过程中，靶基因可能会引入插入或缺失，通过直接提取基因组DNA并扩增靶基因附近片段，可以使用PCR一代测序法进行鉴定。如果检测到偏峰或杂峰，表示产生了有效的基因编辑。同时，AG百家乐还提供适配NGS测序的多种通用型接头供选择，支持后续的质谱分析。质谱分析核心在于测定生物分子的质荷比，以分析其结构。当进行基因编辑检测时，先提取并纯化基因编辑后的细胞或组织样本的蛋白质，随后进行酶解处理以获得肽段混合物。通过电喷雾离子化（ESI）或基质辅助激光解吸离子化（MALDI）等方式转换为气态离子，最后进入质量分析器进行分离和分析。

流式细胞术则基于细胞的光学特性与荧光标记，能够在基因编辑后的细胞样本转化为单细胞悬液后，通过激光激发产生荧光和散射光。通过分析这些信号，绘制荧光强度与细胞数量的直方图，可以计算出成功表达目标蛋白的细胞比例，从而实现对细胞群体的多参数和定量分析。

在下一期中，我们将专注于基因编辑实验中的脱靶问题解决方案，从优化编辑工具到调整实验条件，我们将手把手指导如何提升基因编辑实验的成功率。请持续关注，和AG百家乐一起在基因编辑的道路上披荆斩棘！如需了解AG百家乐提供的基因编辑系列全套解决方案，请联络官方后台申请试用！