AG百家乐细胞培养指南

一、细胞培养条件

细胞名称：生长特性：贴壁生长

冻存条件：无血清冻存液

培养体系：1640 + 10% FBS + 1% P/S + 1% 丙酮酸钠 + 1% L-谷氨酰胺

传代方法：初次建议1:2传代

传代情况：每2天更换培养基

备注：用无菌离心管收集瓶子中的培养基，以备后续对比培养。如果对比效果不理想，建议直接购买AG百家乐的完整培养基。

二、细胞收到后处理

在细胞生长至良好状态后，应将其灌满完整培养液并封好瓶口，以确保运输过程的最佳状态。收到细胞后，可用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，之后在超净台内严格操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态，再进行后续处理。使用显微镜观察细胞生长情况，并拍摄不同倍数的照片存档（最好各留一张40x、100x及200x），前三天的照片为重要售后依据。如未提供照片，则默认收到状态良好。

传代后，建议一瓶使用原瓶的完整培养基，另一瓶使用自配的完整培养基，以便进行对比，换液后将瓶盖拧松。

三、细胞培养步骤

a. 细胞传代

当细胞未超过80%汇合度时，将瓶中完整培养液收集至离心管中，保留5ml完整培养基，并放回37℃、5% CO2孵箱中继续培养；若细胞密度超过80%，则可进行传代，具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2. 加入0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，显微镜下观察细胞消化情况。一旦细胞大部分变圆并脱落，迅速取回操作台，轻敲培养瓶，然后加入5ml以上的完整培养基以终止消化过程。
3. 轻轻吹打使细胞完全脱落后吸出，将悬液转移至离心管中，在1000 RPM条件下离心5分钟，弃去上清液后，补充1-2ml完整培养基重悬。
4. 按1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），添加新的完整培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养。

b. 细胞冻存

1. 细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，弃去T25培养瓶中的培养液，并用PBS清洗一次。
2. 加入0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，观察细胞回缩并变圆后加入5ml完整培养液以终止消化。轻轻吹打细胞使其脱落，并将悬液转移至15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，细胞沉淀后加入1ml的AG百家乐无血清冻存液（货号：C7001），混合后转移至冻存管中。
4. 直接将冻存细胞放入-80℃冰箱中，如需转入液氮罐，需在-80℃中保存24小时以上再转移。

细胞复苏

取出冻存管（注意佩戴防护装备），迅速将其浸入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无冰晶。随后需用75%的酒精擦拭冻存管外壁，将细胞移至含有5ml完整培养基的15ml离心管中，进行1000 RPM离心5分钟。弃去上清，沉淀后用5ml完整培养基重悬，接种至T25培养瓶中，并放回37℃、5% CO2的细胞培养箱中进行培养。第二天换用新鲜完整培养基继续培养。

注意事项

部分细胞在贴壁时不够牢固，运输途中容易脱落，这属于正常情况。如细胞脱落较多，可将所有培养液收集至离心管中，收集上清作过渡培养，随后以胰酶处理细胞再放回培养箱中。

五、售后条款

1) 可重发的情况及判定标准

细胞出现问题可重发的情况包括：

1. 运输途中细胞丢失、瓶身破损或严重漏液，可重发。
2. 细胞污染需在收到产品48小时内提供真实实验结果，经核实后可重发。
3. 常温发货的细胞静置24小时后或干冰发货的细胞复苏24小时后，若大多数细胞未存活（需提供真实的细胞状态照片），可重发。
4. 干冰发货的细胞复苏后24小时或常温发货的细胞静置4小时且未开封，出现污染，可重发。
5. 细胞活性问题需在收到产品7天内提供真实的实验结果，使用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，经核实后可重发。
6. 收到细胞当天及第2、3天需拍照，若3天未告知视为产品合格。若在4-7天内出现问题需提供前三天照片及出现问题时的照片，经过技术人员沟通判断，若为我方责任可重发。

2) 不予重发的情况

以下情况不予重发：

1. 因客户造成的细胞污染，不重发。
2. 因客户不当操作导致细胞状态不佳，不重发。
3. 非AG百家乐推荐培养体系导致的细胞状态不佳，不重发。
4. 细胞状态不佳且未提供前三天照片，不重发。
5. 细胞在培养时经过其他处理，不重发。
6. 收到细胞后2天内未告知，不重发。
7. 具体情况需根据实际进行判断。